|
|
Structural characterization of influenza A polymerase PA subunit domains in complex with novel inhibitors
Radilová, Kateřina ; Kožíšek, Milan (vedoucí práce) ; Rumlová, Michaela (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
RNA-dependentní RNA polymerasa viru chřipky je heterotrimerický komplex, který má zásadní roli v životním cyklu viru. Je zodpovědná za virovou replikaci a transkripci. Jedna z jejích podjednotek, PA podjednotka, interaguje s PB1 podjednotkou prostřednictvím důležité protein-proteinové interakce na své C-koncové doméně. Tato interakce, která je zprostředkovaná 310 helixem, je nutná k utvoření celého heterotrimerického komplexu. N-koncová doména navíc obsahuje místo s endonukleasovou aktivitou se dvěma manganatými ionty. Obě tyto domény jsou považovány za slibné terapeutické cíle. V současnosti jsou přístupy v léčbě a prevenci chřipkového onemocnění limitované na sezónní očkování a existuje pouze několik léků, které ve velké většině cílí na jiné proteiny viru chřipky. U řady z nich však dochází k rychlému vývoji rezistentních mutací, nebo mají závažné vedlejší účinky. Tato práce nabízí strukturní náhledy na dvě domény PA podjednotky. První část se věnuje charakterizaci a optimalizaci minimálního peptidu odvozeného z PB1 podjednotky, který interaguje s C-koncovou doménou PA podjednotky a brání jejich dimerisaci. Výsledky z této části mohou být považovány za počáteční bod pro racionální vývoj prvních inhibitorů PA-PB1 protein-proteinové interakce proti viru chřipky. V druhé polovině jsme zkoumali...
|
|
|
Mass Spectrometry-Based Identification of a Potential Binding Partner of Glutamate Carboxypetidase II
Tužil, Jan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
Český abstrakt Systémová biologie bude vyžadovat použití nových metod s vysokou propustností dat pro studium protein-proteinových interakcí. Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii prošla v posledních letech rychlým vývojem a stala se nepostradatelným nástrojem studia makromolekul v základním i klinickém výzkumu. Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII; EC 3.5.17.21) je transmembránový protein se dvěma známými enzymovými aktivitami. Tento enzym je exprimován ve větším množství v buňkách některých pevných nádorů a také obecně v neovaskulatuře pevných nádorů, nehraje zde však fyziologickou roli. Některé skutečnosti mohou poukazovat na potenciální receptorovou funkci GCPII, přirozený ligand tohoto proteinu však nebyl doposud identifikován. Pro hledání možných vazebných partnerů a/nebo ligandů GCPII byly použity metody afinitní chromatografie, imunoprecipitace a hmotnostní spektrometrie. Byla optimalizována metodika přípravy vzorků pro hmotnostní spektrometrii a analýza získaných dat s cílem nalézt možné vazebné partnery. Jeden z identifikovaných proteinů- β-podjednotka F1 ATP-syntasy, byl vybrán pro důkladnější analýzu možné interakce s GCPII.
|
|
|
Identification of small compounds disrupting protein-protein interaction in influenza A polymerase.
Hejdánek, Jakub ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Virus chřipky napadá ptactvo a savce a způsobuje u nich závažnou infekci, která je ročně příčinou téměř půl milionu lidských obětí. Dodnes jsou terapeutickými cíly pouze dvě molekuly v životním cyklu viru - M2 protonový kanál a neuraminidasa. Vznik nových pandemických subtypů je současně s vývojem resistentních variant proti současným lékům závažným podnětem pro nalezení nových cílů a potenciálně jejich inhibitorů. V nedávné době byla pomocí strukturní krystalografie identifikována protein-proteinová interakce mezi PA a PB1 podjednotkou virové polymerasy jakožto zajímavý therapeutický cíl. Zajímavé je, že tato interakce je zprostředkována jen několika interagujícími aminokyselinovými zbytky. Další zajímavý fakt je, že tyto zbytky vykazují vysokou konzervovanost mezi variantami viru chřipky typu A, což by v případě nalezení inhibitoru mohlo umožnit zacílit širokospektrální léčbu proti všem kmenům tohoto typu viru. V této práci jsem se zabýval expresí a purifikací dvou fúzních rekombinantních proteinových konstruktů C-terminální domény PA podjednotky (CPA) z pandemického subtypu viru chřipky A/California/07/2009 (H1N1). První konstrukt byl navrhnut k evaulaci kinetických vlastností interakce mezi PB1 peptidem a CPA proteinem. Dále byl tento konstrukt použit k vývoji vysoko-kapacitní testovací analýzy...
|
|
|
Identification of small compounds disrupting protein-protein interaction in influenza A polymerase.
Hejdánek, Jakub ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Virus chřipky napadá ptactvo a savce a způsobuje u nich závažnou infekci, která je ročně příčinou téměř půl milionu lidských obětí. Dodnes jsou terapeutickými cíly pouze dvě molekuly v životním cyklu viru - M2 protonový kanál a neuraminidasa. Vznik nových pandemických subtypů je současně s vývojem resistentních variant proti současným lékům závažným podnětem pro nalezení nových cílů a potenciálně jejich inhibitorů. V nedávné době byla pomocí strukturní krystalografie identifikována protein-proteinová interakce mezi PA a PB1 podjednotkou virové polymerasy jakožto zajímavý therapeutický cíl. Zajímavé je, že tato interakce je zprostředkována jen několika interagujícími aminokyselinovými zbytky. Další zajímavý fakt je, že tyto zbytky vykazují vysokou konzervovanost mezi variantami viru chřipky typu A, což by v případě nalezení inhibitoru mohlo umožnit zacílit širokospektrální léčbu proti všem kmenům tohoto typu viru. V této práci jsem se zabýval expresí a purifikací dvou fúzních rekombinantních proteinových konstruktů C-terminální domény PA podjednotky (CPA) z pandemického subtypu viru chřipky A/California/07/2009 (H1N1). První konstrukt byl navrhnut k evaulaci kinetických vlastností interakce mezi PB1 peptidem a CPA proteinem. Dále byl tento konstrukt použit k vývoji vysoko-kapacitní testovací analýzy...
|
|
|
Studium interakce PI4 kinasy IIalfa s VAMP3 proteinem
Dubánková, Anna ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Fosfoinositidy jsou nesmírně důležité pro regulaci aktivity mnoha signálních proteinů nejen buněčné membrány. Fosfatidylinositol - 4 - kinasy (PI4K) katalyzují tvorbu fosfatidylinositolu - 4 - fosfátu, molekuly s významnou regulační funkcí a prekurzoru řady fosfoinositidů. PI4K jsou svou patogenicitou spojovány s některými RNA viry, jako jsou Picornaviridae (poliovirus, coxsackie virus, aichi virus, enterovirus 71) a Flaviviridae (virus hepatitidy C). PI4K také hrají významnou roli při rozvoji rakoviny. Tato práce se snaží přispět k objasnění mechanismu regulace PI4 kinasy typu II α skrze její interakci s proteinem vesikulární membrány 3 (VAMP 3) z rodiny proteinů SNARE (z angl. "Soluble N-ethylmaleimide Sensitive Fusion Attachment Protein Receptor").
|
|
|
Studium interakcí PI4 kinasy
Eisenreichová, Andrea ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent)
14-3-3 proteiny jsou důležitými regulačními bílkovinami, jež se nacházejí ve všech eukaryotních organismech, v lidských buňkách tvoří rodinu 14-3-3 proteinů sedm isoforem. Funkce 14-3-3 proteinů spočívá v interakci s jejich vazebnými partnery, jichž zatím bylo identifikováno několik set. Tito partneři mají klíčové role v mnoha buněčných pochodech, jako je signalizace, regulace buněčného cyklu a dělení, apoptosa a další. Tato bakalářská práce se zabývá studiem interakce 14-3-3 proteinu a fosfatidylinositol 4- kinasy IIIβ (PtdIns4KIIIβ) na molekulární úrovni metodou rentgenové krystalografie. PtdIns4KIIIβ nacházející se na cytosolové straně membrán převážně Golgiho aparátu katalyzuje připojení fosfátové skupiny na čtvrtý uhlík inositolového kruhu. Aktivita PtdIns4KIIIβ je závislá na fosforylaci serinu v pozici 294. Tato fosforylace nejen, že zvyšuje kinasovou aktivitu PtdIns4KIIIβ, ale také je podmínkou pro vazbu 14-3-3 proteinů. Tato interakce zajišťuje ochranu PtdIns4KIIIβ před defosforylací a tak zaručuje nepřetržitou syntézu fosfatidylinositol 4-fosfátu, významné signalizační molekuly a prekursoru pro další fosfátové deriváty fosfatidylinositolu.
|
|
|
Mass Spectrometry-Based Identification of a Potential Binding Partner of Glutamate Carboxypetidase II
Tužil, Jan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
Český abstrakt Systémová biologie bude vyžadovat použití nových metod s vysokou propustností dat pro studium protein-proteinových interakcí. Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii prošla v posledních letech rychlým vývojem a stala se nepostradatelným nástrojem studia makromolekul v základním i klinickém výzkumu. Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII; EC 3.5.17.21) je transmembránový protein se dvěma známými enzymovými aktivitami. Tento enzym je exprimován ve větším množství v buňkách některých pevných nádorů a také obecně v neovaskulatuře pevných nádorů, nehraje zde však fyziologickou roli. Některé skutečnosti mohou poukazovat na potenciální receptorovou funkci GCPII, přirozený ligand tohoto proteinu však nebyl doposud identifikován. Pro hledání možných vazebných partnerů a/nebo ligandů GCPII byly použity metody afinitní chromatografie, imunoprecipitace a hmotnostní spektrometrie. Byla optimalizována metodika přípravy vzorků pro hmotnostní spektrometrii a analýza získaných dat s cílem nalézt možné vazebné partnery. Jeden z identifikovaných proteinů- β-podjednotka F1 ATP-syntasy, byl vybrán pro důkladnější analýzu možné interakce s GCPII.
|
host ::
RSS.